Charakteristika

Pětidenní teoretický kurz s demonstracemi a praktickými cvičeními se intenzivně věnuje moderní metodologii světelné a elektronové mikroskopie. Proti minulým ročníkům má kurz aktualizovaný program o přednášky týkající se nejnovějších technik mikroskopického zobrazování, jako jsou super-rezoluční světelná mikroskopie (SIM/PALM, STED, STORM) či sondová mikroskopie (Atomic force microscopy). Kurz se zabývá i zpracováním obrazových dat, nicméně jeho prioritou je osvojení praktických dovedností mikroskopických technik (obrazová analýza je hlavním tématem kurzu Analýza mikroskopického obrazu). Po absolvování kurzu bude účastník schopen určit, jakou mikroskopickou techniku je vhodné využít pro zodpovězení dané výzkumné otázky včetně přípravy a zpracování dat pro publikaci. Podrobné metodické návody a technická zaškolení jsou ovšem součástí více specializovaných kurzů. Kurz je určen zejména pro doktorandy a mladé vědecké pracovníky v biomedicínských oborech. Řada oborových komisí kurz započítává do splnění studijních povinností doktoranda. Kurz bude vyučován v anglickém jazyce.




Místo konání
Ústav molekulární genetiky AV ČR, Vídeňská 1083, Praha 4 - Krč





Odborní garanti

Prof. Pavel Hozák (ÚMG, AV ČR, v.v.i., Praha)
Dr. Lucie Kubínová (Fyziologický ústav AV ČR, v.v.i., Praha)
Ing. Jana Nebesářová (Parasitologický ústav AV ČR, v.v.i., České Budějovice)



Koordinátoři kurzu
Jana Rohožková Ph.D.
(ÚMG, AV ČR, v.v.i., Praha)
Alžběta Kalendová Ph.D. (ÚMG, AV ČR, v.v.i., Praha)




Obsah kurzu
I. Teoretické základy
Šíření světla a elektronů, optické systémy, vlny, odraz, difrakce, interference, polarizace.
 
II. Světelná mikroskopie
Mikroskop a jeho součásti, formování obrazu, Köhlerovo osvětlení, optické aberace, typy objektivů, fázový kontrast, interferenční kontrast, polarizace, fluorescenční mikroskopie, laserová konfokální mikroskopie, dvoufotonová konfokální mikroskopie, superresoluční mikroskopie, studium dynamických pochodů v živých buňkách, imunofluorescence.
 
III. Elektronová mikroskopie
Vlastnosti elektronů, rozlišovací schopnost, vlnová délka urychleného elektronu, elektron v magnetickém poli. Skenovací elektronový mikroskop: konstrukce, detekce sekundárních a odražených elektronů, tvorba obrazu, vznik rtg. záření a jeho využití pro kvalitativní a kvantitativní mikroanalýzu, příprava biologických preparátů (fixace, odvodnění, sušení preparátů - metoda kritického bodu, mrazové metody přípravy), digitalizace obrazu SEM. Transmisní elektronový mikroskop: konstrukce, tvorba obrazu, interferenční jevy, příprava biologických preparátů (chemické metody - fixace, dehydratace, infiltrace, zalévání, příprava ultratenkých řezů, kontrastování, fyzikální metody - nízkoteplotní postupy, mikrovlny), digitalizace obrazu v TEM. Ultrastrukturální imunoznačení (imunogold). Porovnání fotografického a digitálního záznamu z mikroskopu, CCD kamery. Korelativní mikroskopie. Využití digitalizace a internetu ve virtuální elektronové mikroskopii.
 
IV. Zpracování obrazu
1) Snímání a digitalizace obrazu
Základní pojmy (rozlišení, úrovně šedi, opakovací snímková frekvence), výhody a nevýhody digitálního zpracování, základní ideové schéma digitalizace obrazu. Typy kamer (analogové versus digitální) a jejich významné charakteristiky. Typy digitalizačních karet do PC, tzv. "frame grabbery", základní princip činností. Možnosti použití a dostupnost SW. Konkrétní příklady konfigurací (potencionální dodavatelé) a řešení některých typických problémů. Parametry obrazu (kontrast, šum), histogram. Densitometrická kalibrace. Formáty datových souborů (binární, šedotónový, RGB, HSV, Lab) a komprese (ztrátová, bezztrátová). Filtrace a zpracování obrazu.
 
2) Základní metody segmentace
Detekce oblastí: prahování a růst oblastí, detekce hran: operátory zvýrazňující kontury (Sobel, LoG, DoG), aktivní kontury.

3) Měření geometrických charakteristik digitálního obrazu
Interaktivní metody: poloha, délka, profily, histogramy v ROI. Použití Croftonovy formule pro měření obvodu ve 2D. Interaktivní stereologické metody - systém STESYS a automatické - plocha, obvod, Feretovy průměry, počet, Eulerova charakteristika. Vliv anizotropie objektu a šumu na přesnost měření. 

4) Obrazová analýza a vizualizace ve 3D
Zdroje dat CLSM a MRI, rozměrová kalibrace. Filtrace a segmentace dat. Použití Croftonovy formule pro měření povrchu a délky ve 3D měření. Interaktivní stereologické metody: Fakir probe a Slicer, automatické: objem, počet, povrch a délka ve 3D. Vizualizace: objemové a povrchové ztvárnění.  

V. Stereologie a morfometrie
Tradiční morfometrické metody: měření délek, plochy, obvodu, počtu. Úvod do stereologie. Vzorkování ve stereologii, Cavalieriho princip pro měření objemu, bodová metoda. Příklady stereologických metod pro měření objemu, povrchu, délky a počtu. Metody pro měření délek a povrchu trojrozměrných struktur z tenkých řezů: metoda vertikálních řezů, orientátor. Metody založené na proostřování slinějších řezů: princip disektoru pro počítání trojrozměrných částic (např. buněk), metody pro měření délky prostorových křivek (např. kapilár) a povrchu trojrozměrné struktury.
 





Sponzoři kurzu